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日志

分子生物学之聚合酶链式反应(PCR)

已有 230 次阅读2018-4-27 09:52 | 分子生物学, 聚合酶链式反应, PCR, 小分子生物, 大分子生物

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR),又称无细胞克隆技术,是分子诊断的技术之一,此项技术常应用于分子生物学服务,它是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法,该方法一改传统分子克隆技术的模式,不通过活细胞,操作简便,在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增107108倍,大大提高了DNA的得率。因此,现已广泛应用到分子生物学研究的各个领域。目前我国不少医药研发外包服务机构例如美迪西,提供分子生物学服务,以支持大分子药物,小分子药物、生物制剂、疫苗和生物标记物的筛选与开发及其临床前研究和临床研究。

1、分子生物学技术之PCR技术发展历程:

PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的;最早的应用报道是Saiki1985年将PCR技术应用于β-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断。随后使用了1976Chien等分离的热稳定性Taq DNA聚合酶,使PCR操作大为简化,并使PCR自动化成为可能;1987Kary Mullis等完成了自动化操作装置,使PCR技术进行实用阶段。

  国内复旦大学1988年起开始研制耐热性多聚酶,军事医学科学院马立人教授等在1989年研制成功了PCR自动装置,并且不断推陈出新,最近研制的PTC-51A/BDNA热循环仪体积小,造型美观,价格适宜,操作简单,尤为适宜国内应用。

  PCR发明不到10年,却已获得广泛应用。目前,每年都有上千篇文章发表。1991年,期刊“PCR方法与应用PCr Methods and Application)在美国创刊,使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。PCR技术作为一种方法学革命,必将大大推动分子生物学各有关学科的研究,使其达到一个新的高度。

1993年度诺贝尔化学将已于1013日揭晓,Kary Mullis因发明了聚合酶链式反应而获得此殊荣。现在世界各地都在使用PCR检测病人血液中的微量遗传物质,这一成就为精确诊断艾滋病及其它病症铺平了道路。瑞典皇家科学院说:“PCR方法已经广泛应用于生物医学中。该方法同DNA测序法结合起来很可能将成为研究动植物分类学的一种革新工具。一名加拿大籍英国科学家Michael Smith因开创了寡核苷酸基因定点诱变的方法而与Mullis同享此荣。

2PCR的工作原理:

典型的PCR由(1)高温变性模板;(2)引物与模板退火;(3)引物沿模板延伸三步反应组成一个循环,通过多次循环反应,使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是:将待扩增的模板DNA置高温下(通常为93-94℃)使其变性解成单链;人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合,两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短;耐热的DNA聚合酶(Taq酶)在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入,以目的基因为模板从5’→3’方向延伸,合成DNA的新互补链。

3PCR的用途:

   PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段,并能轻易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此,PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析,还可以用于突变体和重组体的构建,基因表达调控的研究,基因多态性的分析,遗传病和传染病的诊断,肿瘤机制的探索,法医鉴定等诸多方面。通常,PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途:

 (1)生成双链DNA中的特异序列作为探针;

 (2)由少量mRNA生成 cDNA文库;

 (3)cDNA中克隆某些基因;

 (4)生成大量DNA以进行序列测定;

 (5)突变的分析;

 (6)染色体步移;

 (7)RAPDAFLPRFLPDNA多态性分析等。

目前聚合酶链式反应技术已经应用于快速检测多种传染病上面,采用PCR技术的恒温扩增核酸诊断试剂检测盒体积不大,便于携带,检测起来也很方便。取出病人的痰液、血清等病原体样本后,加上裂解液、液化液,使用带核酸亲和膜的注射器提取出微量核酸,不需要传统的离心机处理。经过清洗、洗脱后提取出来的微量核酸放入水浴锅或恒温器中,加入DNA聚合酶后,在不变温度下45分钟即可完成DNA扩增,扩增后的病原体片段有什么状况将清晰地呈现在试纸条上。

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